SHERLOCK: cómo utilizar las herramientras CRISPR en diagnóstico

SHERLOCK: cómo utilizar las herramientras CRISPR en diagnóstico

Imágen ilustrativa del vídeo educativo producido por el instituto BROAD relativa a la nueva aplicación de las herramientas CRISPR, SHERLOCK, diseñada para su utilización en diagnóstico.

Imágen ilustrativa del vídeo educativo producido por el instituto BROAD relativa a la nueva aplicación de las herramientas CRISPR, SHERLOCK, diseñada para su utilización en diagnóstico.

No hay semana en la que no aparezcan publicados nuevos trabajos que describan aplicaciones innovadoras abordadas con las sorprendentes herramientas CRISPR. Hoy más que nunca la difusión, la comunicación de estos avances biotecnológicos es esencial, tanto para estar al día con las nuevas posibilidades que la biotecnología nos ofrece como para explorar las posibles aplicaciones comerciales que las nuevas técnicas nos descubren. Desde este blog de la Asociación de Comunicadores de Biotecnología paso a comentar la que puede ser una de las aplicaciones más inesperadas, y útiles, de las CRISPR, tras la edición genética, esto es, su posible utilización en procedimientos diagnósticos. Toda nueva aplicación requiere un nombre ingenioso, fácil de recordar y relativo a la tecnología desarrollada. En esta caso los investigadores del BROAD han propuesto el acrónimo SHERLOCK (de Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) para denominar a este nuevo uso de las CRISPR.

Las CRISPR constituyen en orígen uno de los mecanismos de defensa, adaptativo, que usan las bacterias para defenderse de los invasores que regularmente les atacan (virus, plásmidos,…). Las CRISPR fueron descubiertas por el microbiólogo español Francis Mojica (Universidad de Alicante), quien las describió por vez primera en arqueas (unos microorganismos procariotas, como las bacterias, pero distintos a ellas), quien les puso el nombre de CRISPR y  quien se dio cuenta por primera vez de su implicación en inmunidad bacteriana. Años después, a partir de 2012, tras las investigaciones y trabajos de diversos equipos, los sistemas CRISPR fueron redescubiertos y presentados como extraordinarias herramientas para la edición genética de una forma precisa, rápida, eficaz y asequible. Son muchas las aplicaciones CRISPR que ya han aparecido, en los poco más de cuatro años de andadura de esta revolución tecnológica, tanto en biología, como en biomedicina o biotecnología. Yo suelo comentar, en mis seminarios sobre este tema, que el único límite para desarrollar aplicaciones basadas en las herramientas CRISPR está en la imaginación de los investigadores.

Esta semana pasada ha aparecido en la revista Science un nuevo uso de CRISPR, ahora en diagnóstico, con un futuro muy prometedor. Veamos cómo los investigadores del Instituto BROAD (MIT, Boston, EEUU), liderados nuevamente por Feng Zhang, han conseguido llegar a desarrollar esta sorprendente tecnología de diagnóstico, usando CRISPR. Para ello necesitamos saber primero cómo funcionan, básicamente, estas herramientas CRISPR. Los sistemas CRISPR utilizan unas proteínas, denominadas Cas, que son, en esencia, unas enzimas de restricción (que cortan el ADN) programables, muy especializadas. Las proteínas Cas son capaces de identificar secuencias genéticas específicas en el genoma, en el ADN, guiadas por pequeñas moléculas de ARN (denominadas guías) y, tras el reconocimiento de la guía de ARN con su secuencia de ADN complementaria, las mismas proteínas Cas se encargan de cortar las dos cadenas del ADN diana en posiciones precisas. Esta rotura del ADN propicia la activación de los mecanismos de reparación que tenemos en todas nuestras células, y en todas las células de cualquier organismo eucariota (animales, plantas, levaduras, hongos,…) que acaban restaurando la continuidad del genoma, aunque para ello produzcan mutaciones en la zona de reparación, inserciones y deleciones (INDELs) de nucleótidos, que suelen conducir a la inactivación del gen. En otras ocasiones, si al sistema se le ofrece secuencias específicas de ADN homólogas a la zona de reparación es posible que los sistemas de reparación usen este molde externo, lo cual conduce a la introducción de secuencias precisas en lugares determinados del genoma, es decir, a la edición genética. La proteína Cas más conocida y utilizada hoy en día es la Cas9 de una bacteria, Streptococcus pyogenes. Debido a las funciones que realizan estas proteínas Cas se denominan endonucleasas de ADN dirigidas por ARN. Sin embargo hoy conocemos que existen otras proteínas Cas que son capaces de cortar moléculas de ARN (en lugar de ADN), dirigidas también por guías de ARN. Es el caso de la proteina Cas inicialmente denominada C2c2 (hoy renombrada como Cas13a), que fue descrita hace menos de un año por el propio equipo de Feng Zhang, en colaboración con otros investigadores. La proteína Cas13a es por lo tanto una endonucleasa de ARN dirigida por ARN. En su momento ya se pensó que la Cas13a podría dar mucho juego, sobre todo en aplicaciones de análisis de la expresión génica, al ir dirigida su actividad hacia ARN y no hacia ADN.

Feng Zhang (BROAD) investigador responsable de la nueva aplicación CRISPR de diagnóstico SHERLOCK. Imágen del vídeo educativo producido por BROAD para presentar la tecnología SHERLOCK.

Feng Zhang (BROAD) investigador responsable de la nueva aplicación CRISPR de diagnóstico SHERLOCK. Imágen del vídeo educativo producido por BROAD para presentar la tecnología SHERLOCK.

Muy pronto Feng Zhang y sus colaboradores se dieron cuenta de una actividad colateral, inesperada, de corte inespecífico de cualquier ARN, que aparecía asociada a la proteína Cas13a tras activarse, es decir, tras acomplejarse con la guía de ARN y tras encontrar su molécula de ARN complementaria. En otras palabras, cuando la proteina Cas13a unida a una guía de ARN determinada encuentra su secuencia de ARN complementaria, no solo empieza a cortar esta secuencia sino cualquier otra secuencia de ARN que encuentre, de forma inespecífica. Esto es, sin duda, un problema importante y una limitación para el posible uso de Cas13a en edición genética. Sin embargo, ha resultado ser una oportunidad sorprendente para convertir el sistema Cas13a en un procedimiento diagnóstico, denominado SHERLOCK, gracias a la imaginación de los investigadores del BROAD. Mezclando en el tubo de ensayo las muestras a analizar con pequeñas moléculas de ARN asociadas a compuestos fluorescentes inactivos, que solamente empiezan a brillar cuando se corta el ARN, han conseguido ligar la identificación de secuencias específicas de ARN a una señal fluorescente, fácilmente detectable. Si en la muestra problema existen secuencias de ARN complementarias a la guía de ARN de la proteína Cas13a esta empezará a cortar todos los ARN de la mezcla, incluidos los que desatarán una señal fluorescente tras ser degradados. Esta es una técnica sorprendentemente sencilla, y poderosa.

La especificidad de la tecnología SHERLOCK reside en la propia proteína Cas13a, capaz de discriminar entre dos secuencias de ARN que se diferencien solamente en un nucleótido, en una letra. Cas13a solamente se activa si la guía de ARN encuentra exactamente su secuencia complementaria. Para aumentar la sensibilidad del proceso los investigadores someten a la muestra inicial a una serie de amplificaciones y transformaciones de ADN a ARN, usando la enzima T7 RNA polimerasa, la cual funciona a temperatura corporal, es decir, a +37 grados (simplemente manteniendo la muestra entre nuestros dedos), sin necesidad de requerir equipos termocicladores como los que se usan habitualmente en las técnicas de detección por PCR. Esto es una ventaja obvia si se piensa convertir esta tecnología en kits de detección de patógenos virales en territorios en los que difícilmente puede encontrarse una máquina de PCR, como algunas zonas de África, por ejemplo. Los investigadores del BROAD demuestran el uso de SHERLOCK detectando la presencia del virus Zika o del Dengue (o ADN de células tumorales) a partir de muestras de sangre de pacientes, con una sensibilidad atto-molar, es decir, de 10exp(-18), capaces de detectar una molécula de ARN viral entre un trillón (un millón de billones) de moléculas de ARN. Un artículo de Stat compara esta sensibilidad a la de ser capaz de detectar agua salada tras disolver una pizca de sal en el Lago Superior de EEUU, el mayor de los grandes lagos de agua dulce en NorteAmérica, con un volumen de 12,000 Km3 de agua (doce mil billones de litros de agua).

La aplicación SHERLOCK, para la cual el instituto BROAD ya ha solicitado la correspondiente patente, puede revolucionar los métodos actuales de diagnóstico, habitualmente basados en anticuerpos (como el test de embarazo) o en la amplificación de secuencias de ADN mediante la reacción de la polimerasa en cadena, la PCR (como el test del virus VIH, agente causal del SIDA). Los reactivos necesarios para SHERLOCK pueden congelarse y descongelarse, o desecarse y rehidratarse, es decir, las reacciones químicas pueden tener lugar en superficies sólidas, como una tira de papel reactivo. La estimación inicial del coste del diagnóstico es de aproximadamente 50 céntimos de Euro (0,61 $) por muestra analizada. Esta será previsiblemente una nueva revolución biotecnológica, colateral, surgida de las sorprendentes herramientas CRISPR. Si pensamos que existen muchas otras proteínas Cas en centenares de miles, sino millones, de bacterias, todavía por descubrir y caracterizar, parece lógico esperar que SHERLOCK no será la última de las aplicaciones inesperadas que surgirán a partir de las CRISPR. Asi pues, preparémonos ya para la siguiente revolución tecnológica derivada de las CRISPR!

 

Lluis Montoliu
montoliu@cnb.csic.es

Lluís Montoliu es investigador científico del CSIC en el Centro Nacional de Biotecnología, investigador del Centro de Investigación Biomédica en Red en Enfermedades Raras (CIBER-ER), del ISCIII, y profesor honorario de la Universidad Autónoma de Madrid. En su laboratorio investiga en temas básicos (cómo se organizan los genes en el genoma para funcionar todos correctamente) y aplicados (modelos animales para el estudio de enfermedades raras humanas, como el albinismo). Ha trabajado con organismos modificados genéticamente desde 1986, realizando su tesis doctoral en biología molecular de plantas, en maíz, y posteriormente sus estudios se han centrado en el ratón, como modelo animal experimental, desde 1989. En 2006 contribuyó a fundar la International Society for Transgenic Technologies (ISTT) de la que fue su Presidente hasta 2014. Además de la investigación le interesa y apasiona la formación y la divulgación científica.