Las herramientas CRISPR: un regalo inesperado de las bacterias que ha revolucionado la biotecnología animal

Ejemplo de utilización de la tecnología CRISPR-Cas9 en ratones, para investigar la función de secuencias de ADN no codificantes del gen de la tirosinasa, implicada en la síntesis de melanina. El ratón editado mediante CRISPR-Cas9 (izquierda) muestra alteraciones en la pigmentación que no presenta el ratón silvestre, de referencia (a la derecha). Estos resultados se describen en el artículo científico Seruggia et al. 2015 Nucleic Acids Research, May 26;43(10):4855-67. doi: 10.1093/nar/gkv375

Ejemplo de utilización de la tecnología CRISPR-Cas9 en ratones, para investigar la función de secuencias de ADN no codificantes del gen de la tirosinasa, implicada en la síntesis de melanina. El ratón editado mediante CRISPR-Cas9 (izquierda) muestra alteraciones en la pigmentación que no presenta el ratón silvestre, de referencia (a la derecha). Estos resultados se describen en el artículo científico Seruggia et al. 2015 Nucleic Acids Research, May 26;43(10):4855-67. doi: 10.1093/nar/gkv375 (Fotografía: Davide Seruggia)

Hace poco más de dos años apareció un artículo científico publicado en la revista Cell que nos dejó boquiabiertos a todos quienes nos dedicamos a la biotecnología animal. En ese estudio se describía, por vez primera en ratones, una nueva forma de generar animales modificados genéticamente, mucho más rápida, precisa, eficaz, versátil y asequible. La generación de ratones transgénicos, mutantes o alterados genéticamente, por ejemplo, con fines biomédicos, con el objetivo de obtener modelos animales para el estudio de enfermedades humanas, era algo que sabíamos hacer desde la década de los años 80, del siglo pasado. Durante estos más de 30 años la tecnología que usábamos había cambiado naturalmente en algunos detalles, pero en lo substancial había evolucionado relativamente poco. La estrategia que diseñaron los investigadores Martin Evans, Mario Capecchi y Oliver Smithies para generar ratones mutantes específicos de un determinado gen, usando las células troncales embrionarias, y que les condujo a recibir el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2007, seguía siendo el método de referencia en nuestros laboratorios en 2013, cuando apareció el mencionado artículo que ha desatado una verdadera revolución en la biotecnología animal.

Casi nadie podía sospechar que unas secuencias de ADN repetidas, descubiertas en bacterias en 1987 y en arqueas en 1993, y posteriormente interpretadas como parte de uno de los sistemas inmunes propios de las bacterias (que usan para defenderse de los virus que les atacan), se convertirían en una de las herramientas más sorprendentes que ha producido la biotecnología para modificar, a voluntad, y con una facilidad pasmosa, el genoma de cualquier organismo. Sin embargo, las investigadoras Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna, tras años de investigación básica en microbiología y biología estructural, sí se dieron cuenta que este sistema de defensa de las bacterias, que se conocía como CRISPR desde 2002, podía convertirse fácilmente en una herramienta para la modificación dirigida del material genético de otros seres vivos. Tras diversos estudios realizados de forma independiente publicaron sus resultados conjuntamente en un artículo científico en la revista Science en agosto de 2012, que realmente fue la chispa que encendió la explosión posterior, encabezada por el artículo publicado en Cell en mayo de 2013. La magnitud de la revolución iniciada por estas dos investigadoras puede apreciarse por los premios y distinciones de prestigio que están recibiendo constantemente, entre los que destacan el Premio Princesa de Asturias de Investigación Científica y Técnica 2015, o el premio de la Sociedad Internacional de Tecnologías Transgénicas (ISTT), entre muchos otros. Y sus nombres suenan cada vez con más intensidad para el mayor de los galardones científicos.

¿Qué tiene de sorprendente el sistema CRISPR-Cas9? Su simplicidad y su extraordinaria eficacia. Este es un sistema de defensa optimizado durante miles de millones de años por las bacterias para lograr zafarse de los ataques de virus que les acechan constantemente en el medio ambiente. En esencia consta de dos elementos: una pequeña molécula de ARN (la parte CRISPR), que contiene una secuencia complementaria con la secuencia diana contra la que se dirige, en el ADN; y una endonucleasa (denominada Cas9), una proteína con actividad enzimática que es capaz de cortar el ADN y hacerlo solamente donde le indique la pequeña molécula de ARN mencionada. Al cortar la doble cadena de ADN de cualquier organismo en una posición determinada, una de las agresiones más peligrosas que puede recibir un genoma, pues representa la pérdida de la continuidad de la molécula de ADN, se pone en marcha un mecanismo ancestral, también existente en bacterias, que persigue reparar este corte cuanto antes. Para ello diversas enzimas, existentes en todas nuestras células, se encargan de empezar a digerir y reconstruir segmentos de ADN colindantes al corte, con objeto de localizar o generar alguna complementariedad que permita enganchar los dos extremos y restaurar la continuidad de la molécula de ADN. Durante este proceso se cometen errores y el sellado suele ir acompañado de la inserción o eliminación de algunos nucleótidos, las letras A, T, G, C que constituyen los genomas. Por lo tanto el resultado final es que allí donde se había producido un corte, al repararse éste, aparece una alteración genética, una mutación. Por lo tanto, mediante estas herramientas CRISPR-Cas9, dirigiendo un corte de ADN a una secuencia genética determinada, a un gen específico, se consigue generar una mutación específicamente en ese gen.

Las sorpresas no acaban ahí. Si, además, le damos un tercer elemento al sistema CRISPR-Cas9, una molécula de ADN que tenga secuencias complementarias alrededor de la zona donde se producirá el corte, e incorporamos en esta secuencia determinados cambios específicos, que no estuvieran presentes en el genoma original, el sistema tenderá a utilizar esta molécula de ADN como molde para restaurar el corte y, al hacerlo, cambiará el genoma. Lo habremos editado. Como si de un procesador de textos se tratara el sistema CRISPR-Cas9 y la molécula de ADN consiguen localizar un error y corregirlo en un gen, o, viceversa, instaurar un error donde antes no lo había, reproduciendo así en un modelo animal experimental aquella mutación detectada en un paciente afectado por una enfermedad de la cual se desconoce su efecto, sus consecuencias. El sueño de cualquier genetista, de cualquier biotecnólogo animal. No solamente somos capaces de modificar el genoma de nuestros modelos animales sino que podemos reproducir las mismas mutaciones que observamos en los pacientes, para estudiar cuáles son sus efectos y entender mejor la enfermedad, algo que antes ya era posible pero técnicamente difícil de abordar, y muy costoso, en tiempo, dinero y número de animales, y con metodologías que solamente estaban al alcance de los grandes centros de investigación en biomedicina.

¿Cuáles son los beneficios de generar animales mutantes con las herramientas CRISPR-Cas9? Es muy fácil de entender. Para generar un ratón mutante con la tecnología clásica de referencia se tardaba entre 8 y 12 meses de trabajo intenso en laboratorios muy especializados y expertos en las técnicas de modificación genética. Para generar un ratón mutante con las herramientas CRISPR-Cas9 se tarda de 1 a 2 meses en cualquier laboratorio mínimamente familiarizado con las técnicas básicas de biología molecular. Además, la generación de varios mutantes, posible antaño, alargaba mucho más el proceso, mientras que con las herramientas CRISPR-Cas9 pueden generarse, con idéntica facilidad, de forma simultánea, y en el mismo tiempo, mutaciones múltiples, que afecten a muchos genes. Simplemente hay que mantener la endonucleasa Cas9 y multiplicar oportunamente el número de pequeñas moléculas de ARN, una por cada gen que deseemos alterar. Y dejar que el sistema actúe. La proteína Cas9, cual tijera, cortará diligentemente en todas y cada una de las posiciones que le hayamos indicado, sean una o varias, le dará lo mismo, y lo hará sin rechistar.

¿Sorprendente? Sí. Y también una realidad. Una realidad que se ha extendido rapidísimamente por los centros de investigación biomédica de todo el mundo, en parte gracias a entidades como addgene tremendamente eficaces distribuyendo los elementos básicos para que cualquier laboratorio de cualquier parte del mundo pueda empezar a usar estas herramientas CRISPR-Cas9. ¡Y se trata de una técnica muy agradecida, robusta, que funciona! No hay nada como importar herramientas de las bacterias para que el éxito esté garantizado. Contamos con la ventaja de que ellas ya han mejorado, pulido cualquier sistema durante los miles de millones de años que llevan viviendo en la Tierra. Siempre que los animales (o las plantas) hemos tenido algún problema o reto genético que solucionar las bacterias han acudido en nuestra ayuda. Son una fuente inagotable de herramientas, de nuevas estrategias para la modificación genética, para el estudio de nuestros genomas.

¿Tiene alguna limitación este sistema? En Biología, en Biotecnología no existen los métodos o estrategias perfectas. La especificidad del corte de la proteína Cas9 vendrá determinada por la secuencia de ARN que dirija el corte a un sitio determinado del genoma y por la permisividad de la endonucleasa si se contenta con emparejamientos incompletos, en secuencias parecidas pero no idénticas. Debido a que nuestros genomas, sean de ratones o humanos, contienen muchas secuencias repetitivas, parecidas, si seleccionamos como secuencia diana una que esté presente muchas veces en un genoma provocaremos lo obvio, que se pierda la especificidad del corte y acaben alterándose muchos más genes de los inicialmente previstos. Por ello se han desarrollado recursos bioinformáticos que ayudan al investigador en su tarea de seleccionar qué secuencias de ADN pueden y deben usarse como dianas, con garantías de que estén representadas muy pocas veces en el genoma, idealmente únicas, y que permitan asegurar, con una determinada probabilidad, que solamente el gen diana, y no otros parecidos, se verá alterado. El temor inicial a una cierta promiscuidad del sistema cada vez se está despejando, al constatarse que las herramientas CRISPR-Cas9 son mucho más precisas y específicas de lo que imaginábamos.

¿Pueden aplicarse las herramientas CRISPR-Cas9 para modificar el genoma humano? En principio no hay nada que distinga a un embrión humano de un embrión de ratón para que sus correspondientes genomas puedan ser editados con estas nuevas herramientas. De hecho, en países en los que estos experimentos son posibles, como China, se acaban de publicar los primeros intentos de modificar el genoma humano realizados sobre embriones humanos no viables derivados de clínicas de infertilidad. Y los investigadores chinos han constatado lo obvio, lo mismo que otros investigadores habíamos visto en ratones y otras especies animales, que la técnica todavía no es lo suficiente segura ni fiable para su traslado desde los modelos experimentales a la clínica, para garantizar que las alteraciones genéticas precisas solamente ocurran en los genes previstos y de la forma esperada. Un nuevo ejemplo de por qué debemos seguir investigando con la ayuda de modelos animales, antes de saltar a los seres humanos.

Es evidente que la posibilidad real de modificar el genoma humano abre debates en nuestra sociedad más allá de la ciencia. Son muchos los posicionamientos y escritos que han aparecido, a favor y en contra de este posible uso, con todos sus matices. En mi opinión, los investigadores en biomedicina y biotecnología debemos seguir avanzando y aportando a la sociedad nuestro conocimiento, el resultado de nuestras investigaciones, de estrategias terapéuticas cada vez mejores y más eficaces para su eventual uso en humanos, para el tratamiento y la prevención de enfermedades. Y será después la sociedad, a través de sus representantes, con los datos e información adecuada, quien decidirá cuando está preparada para aceptar y trasladar estos avances científicos a las personas. La fecundación in vitro cuando se implantó en las clínicas de infertilidad humanas en los años 70 provocó un gran debate y rechazo en determinados sectores de la sociedad. Sin embargo hoy en día hay millones de niños y niñas nacidos gracias a esta técnica, ya rutinaria en muchos hospitales, y el médico que la desarrolló, Robert G. Edwards, recibió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en el año 2010.

Nuestro laboratorio, debido a un cúmulo de circunstancias favorables, fue de los primeros que empezó a utilizar con éxito esta nueva técnica de las herramientas CRISPR-Cas9 en ratones en nuestro país, ya desde sus inicios, en el año 2013. Hemos compartido el éxito con nuestros colegas, y enseñado a utilizar estas herramientas a muchos otros laboratorios, a través de estancias, colaboraciones, cursos y publicaciones y también a través de páginas web informativas abiertas a cualquier investigador interesado.

Para terminar, una reflexión y una perspectiva histórica.

Una reflexión: Las herramientas CRISPR-Cas9 son un ejemplo extraordinario de cómo una investigación básica (el sistema inmune de las bacterias), aparentemente alejada de las investigaciones aplicadas finalistas, puede llegar a convertirse en una aplicación tremendamente útil (la modificación de cualquier genoma a voluntad) en biología, biotecnología y biomedicina. Ilustra magníficamente como cualquier sistema público o privado de investigación debe continuar invirtiendo en ciencia básica, no finalista, pues hay que sembrar en muchas direcciones, hay que ir descubriendo lo desconocido, para poder recolectar años después allí donde se hayan dado las condiciones para que la semilla germine y florezca, allí donde haya saltado la chispa!.

Una perspectiva histórica: Muchos investigadores todavía desconocen que en España contamos con uno de los primeros microbiólogos que descubrieron las CRISPR en arqueas en 1993. Francisco Juan Martínez Mojica (Universidad de Alicante) realizó su tesis doctoral con estas secuencias repetidas y ha seguido estudiándolas sistemáticamente durante toda su carrera científica, aislándolas y describiéndolas en muchas especies de arqueas y bacterias. Tanto es así que fue quien acuñó el término CRISPR (acrónimo del inglés Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) que es el que ahora utiliza toda la comunidad científica internacional, como le reconocieron unos microbiólogos holandeses en 2002, y fue también quien primero sugirió que estas secuencias podían estar relacionadas con la inmunidad de las bacterias a la infección por determinados virus, en 2005, dos años antes que se descubriera y publicara que, efectivamente, las CRISPRs son una parte de un sistema inmune de las bacterias. Francisco J. M. Mojica intuyó que estos sistemas CRISPR-Cas podrían tener aplicaciones en biología y en biomedicina, principalmente desde el punto de vista de poder estudiar y modificar la inmunidad de las bacterias, para poder combatirlas con mayor eficacia. Sin embargo no imaginó que fueran a ser tan útiles en animales para la edición de genomas. Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna sí se percataron del potencial que albergaban estas herramientas CRISPR-Cas9, y por ello están recibiendo los honores, con todo merecimiento. Sin embargo ellas no olvidan que no hubieran podido avanzar en sus investigaciones sin el trabajo pionero y sistemático de microbiólogos básicos como Francisco J. M. Mojica y por eso le reconocieron el crédito que merecía citando los experimentos del investigador alicantino de forma relevante en su ya famosa revisión publicada en Science en noviembre de 2014. El merecido aunque tardío reconocimiento le llegó a Francis J.M. Mojica desde el extranjero.

Lluís Montoliu  @LluisMontoliu
Investigador Científico del CSIC
Centro Nacional de Biotecnología

2 Respuestas

  1. […] Las herramientas CRISPR: un regalo inesperado de las bacterias que ha revolucionado la biotecnologí… […]

  2. Excelente revisión Lluis, gracias por compartir con nosotros este conocimiento y ponernos al dia.

  3. […] las cuales permiten la edición de genomas de forma mucho más sencilla, precisa y eficaz, como las herramientas CRISPR, está planteando nuevos retos a la legislación sobre OMG. Mediante el uso de las herramientas […]

  4. Este artículo ha sido incluido en el número Octubre 2015/Trimestre 2/Número 37 de la revista BIÓLOGOS del Colegio Oficial de Biólogos de la Comunidad de Madrid (COBCM)
    http://www.cobcm.net/COBCM/
    revista: http://es.calameo.com/read/0015383155e415db453bc

  5. […] mayo como el nuevo sistema corta-pega de edición genómica que iba a substituir e incluso mejorar las herramientas CRISPR-Cas, realmente no funcionaba tal y como se había publicado. Gracias a diferentes iniciativas de […]

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